肽核酸（PNA）端粒探针荧光原位杂交（FISH）实验方案

原理上，荧光原位杂交（FISH）技术应能提供单个染色体的端粒长度信息。直接标记的寡核苷酸探针因其尺寸?。ù┩感院茫⒌チ葱灾剩ㄎ扌杼秸氡湫裕┘翱煽刂坪铣傻忍氐?，成为此类分析中有吸引力的探针。

然而，针对端粒重复序列的寡核苷酸杂交效率有限，该方法仅能用于不同物种染色体中TTAGGG重复序列的定性研究。近期研究表明，肽核酸（PNA）寡核苷酸探针可与互补寡核苷酸序列杂交，且形成的双链稳定性高于DNA/DNA或DNA/RNA双链。

在PNA中，传统DNA和RNA寡核苷酸的带电磷酸-（脱氧）核糖骨架被由重复的N-（2-氨基乙基）-甘氨酸单元通过肽键连接而成的不带电骨架所取代。与DNA寡核苷酸相比，PNA寡聚体具有更高的序列特异性、更好的稳定性、可重复性以及更低的背景信号。由于PNA/DNA双链的解链温度（Tm）更高，短链（18聚体）端粒PNA探针（CCCTAA）?被广泛应用。

实验前准备

一、端粒PNA探针制备

1.  打开试管前先离心，使冻干的PNA探针聚集在试管底部。

2.  向试管中加入甲酰胺，配制PNA探针储备液。

3.  用PNA杂交缓冲液稀释储备液，使终浓度达到200nM。

? 注意：探针溶液需避光，4℃储存。

二、溶液制备

1.  杂交缓冲液

20mM 磷酸氢二钠（Na?HPO?），pH 7.4

20mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris），pH 7.4

60% 甲酰胺

2×标准柠檬酸盐溶液（SSC）

0.1μg/ml 鲑鱼精DNA

2.  核糖核酸酶A（RNase A）溶液

在2×SSC中加入RNase A，终浓度为100μg/ml

3.  0.005%胃蛋白酶溶液

取50μl 5%胃蛋白酶储备液，加入50ml 0.01M盐酸（HCl）中稀释。

? 注意：现配现用！使用前预热至45℃。

4.  洗涤液

2×SSC/0.1%吐温-20（Tween-20）

杂交与洗涤步骤

一、预处理

1.  按照特定细胞系的推荐流程制备玻片，自然晾干。

2.  将玻片浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，孵育15分钟。

3.  用含4%多聚甲醛的PBS溶液在37℃下固定玻片4分钟。

4.  加入500μl RNase A溶液，37℃孵育1小时。

5.  向洁净培养皿中加入500μl RNase A溶液，将每张玻片的样本面朝下置于溶液上，37℃孵育1小时。

? 注意：避免玻片干燥。

6.  用2×SSC洗涤（重复3次），再用去离子水（DW）洗涤。

7.  将玻片浸入0.005%胃蛋白酶溶液中，37℃孵育4分钟。

8.  用PBS在37℃下洗涤3分钟（重复2次）。

9.  重复步骤3-4。

10. 在室温下用PBS洗涤5分钟。

11. 用梯度冷乙醇脱水（70%、85%、100%乙醇各浸泡1分钟）。

12. 自然晾干玻片。

二、杂交

1.  将玻片放入预热至80℃的培养箱中，孵育5分钟。

2.  向每张玻片的标记区域加入20μl含PNA探针的杂交缓冲液。

? 注意：杂交缓冲液使用前需在90℃加热5分钟。

3.  用18×18mm盖玻片覆盖玻片的标记区域。

? 注意：避免玻片干燥。

4.  将玻片在85℃下变性10分钟。

? 注意：变性温度需控制在80℃-90℃之间。

仔细检查培养箱温度。

变性温度低于75℃会严重影响实验结果。

5.  将玻片置于避光环境中，室温孵育1小时。

三、洗涤

1.  将玻片浸入室温下的洗涤液中，移除盖玻片。

2.  在55-60℃下用洗涤液洗涤玻片10分钟（重复2次）。

? 注意：洗涤温度需严格控制在55-60℃。

3.  在室温下用洗涤液洗涤玻片1分钟。

四、复染

1.  将玻片浸入DAPI/2×SSC溶液中，染色10分钟。

2.  用2×SSC洗涤玻片2分钟。

3.  用1×SSC洗涤玻片2分钟。

4.  用去离子水（DW）洗涤玻片2分钟。

5.  离心干燥玻片。

6.  在玻片的目标区域滴加一滴封片液。

7.  盖上盖玻片，使封片液在盖玻片下均匀扩散，避免产生气泡。

8.  使用配备相应滤光片的荧光显微镜观察染色后的玻片。

参考文献

1. Kentaro Taemura 等，2005年，《发育生物学》（Developmental Biology），第281卷，196-207页。

2. Won-Wo Woo Lee 等，2002年，《免疫学》（Immunology），第105卷，458-465页。

3. Heather Perry 等，2001年，《微生物学方法杂志》（Journal of Microbiological Methods），第47卷，281-292页。

4. Caifu Chen 等，1999年，《哺乳动物基因组》（Mammalian Genome），第10卷，13-18页。

5. M. Hultdin 等，1998年，《核酸研究》（Nucleic Acids Research），第26卷（16期），3651-3656页。

6. Peter M. Landsdorp 等，1996年，《人类分子遗传学》（Human Molecular Genetics），第5卷（5期），685-691页。

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